Subtilisin-like Proprotein Convertase PACE4 is Required for Skeletal Muscle Differentiation

Most growth factors stimulate myoblast proliferation and prevent differentiation, whereas insulin-like growth factors (IGFs) promote myoblast differentiation through the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway. Subtilisin-like proprotein convertases (SPCs) are involved in cell growth and differentiation via activation of pro-growth factors. However, the role of SPCs in myogenesis remains poorly understood. Here we show that PACE4, a member of the SPC family, plays a critical role in myogenic differentiation of C2C12 cells. PACE4 mRNA levels increased markedly during myogenesis, whereas the expression of other member of SPC family, furin and PC6, remained unchanged. The expression pattern of pro-IGF-II, which is processed extracellularly by SPCs, was similar to that of PACE4. The expression of shRNA targeting PACE4, but not furin, suppressed the expression of the muscle-specific myosin light chain (MLC). Interestingly, reduced expression of MLC was restored following treatment with recombinant mature IGF-II. Finally, we demonstrated that the PI3K inhibitor LY294002 blocked the induction of PACE4 mRNA, a result not observed when another myogenic differentiation inhibitor, SB203580 (p38 MAP kinase inhibitor), was employed, indicating the presence of a positive feedback loop regulating PACE4 expression. These results suggest that PACE4 plays an important role in myogenic differentiation through its association with the IGF-II pathway.


Transcriptional Regulation of Fibrillin-2 Gene by E2F Family Members in Chondrocyte Differentiation

Mutation in fibrillin-2, a major structural component of extracellular microfibrils in connective tissue, results in the autosomal dominant disease congenital contractural arachnodactyly. This genetic disease is characterized by dolichostenomelia and arachnodactyly, in addition to contractures of the large joints and abnormal pinnae formation, thus indicating the significance of fibrillin-2 in chondrogenesis. In this study, we investigated the transcriptional regulation of fibrillin-2 in chondrogenic differentiation. Although mRNA expression of fibrillin-1, a highly homologous protein to fibrillin-2, remained almost unchanged during chondrogenesis of mouse ATDC5 cells, fibrillin-2 mRNA expression varied. Fibrillin-2 was highly expressed at the early stage and declined progressively during differentiation. The 5'-flanking region of the fibrillin-2 gene contains potential binding sites for E2F, Runx, AP-2, and Sox transcription factors. The promoter activity of fibrillin-2 decreased markedly following deletion and mutagenesis of the E2F binding site between -143 and -136 bp. Overexpression of E2F1 resulted in a marked increase in its promoter activity, whereas expression of other transcription factors including AP-2alpha and Runx2 had no effect. The increase in promoter activity by E2F1 was completely suppressed by the coexpression of E2F4. E2F2 and E2F3 had positive effects on the promoter activity. Although ATDC5 cells expressed transcripts for the E2F family genes at all stages of differentiation, the expression profiles differed. E2F1 expression remained almost unchanged, whereas E2F4 expression increased markedly at the late stage of differentiation. These results indicated that coordinated expression of the E2F family is critical for the transcriptional regulation of fibrillin-2 during chondrogenesis.


Transcriptional regulation of subtilisin-like proprotein convertase PACE4 by E2F: Possible role of E2F-mediated upregulation of PACE4 in tumor progression

PACE4, a member of the subtilisin-like proprotein convertase (SPC) family, is expressed at high levels in certain tumor cells and plays a role in metastatic progression through activation of matrix metalloproteinases. The mechanism leading to overexpression of PACE4 in tumor cells remains unclear. In this study, we show that the E2F1 transcription factor, which is implicated in carcinoma invasiveness, upregulates the expression of PACE4. HT1080 (highly tumorigenic and invasive) cells expressed much higher levels of PACE4 and E2F family (E2F1 and E2F2) transcripts than IMR90 (normal fibroblast) cells. Expression levels of other SPCs (furin and PC6) remained unchanged in these cells. Promoter analysis indicated that two E2F consensus binding sites (-117/-110 and -86/-79) in the 5'-flanking region of the human PACE4 gene function as positive regulatory elements. Mutation of these sites abolished PACE4 promoter response to E2F1 as well as binding of E2F1 in electrophoretic mobility-shift assays. Other E2F members, E2F2 and E2F3, also activated PACE4 expression, as in the case of E2F1. These results indicate a novel mechanism for E2F family-mediated promotion of carcinoma invasiveness through PACE4.


Engineering of α1-antitrypsin cariants selective for subtilisin-like proprotein convertases PACE4 and PC6: Importance of the P2' residue in stable complex formation of the serpin with proprotein convertase

Furin and PACE4, members of the subtilisin-like proprotein convertase (SPC) family, have been implicated in the metastatic progression of certain tumors in addition to the activation of viral coat proteins and bacterial toxins, indicating that these enzymes are potential targets for therapeutic agents. Alpha1-Antitrypsin Portland is an engineered alpha1-antitrypsin designed as a furin-specific inhibitor and has been used as a tool in the functional analysis of furin. In this work, we engineered rat alpha1-antitrypsin to create a PACE4-specific inhibitor. Substituting Arg-Arg-Arg-Arg for Ala-Val-Pro-Met(352) at P4-P1 and Ala for Leu(354) at P2' created a potent PACE4- and PC6-specific inhibitor. This variant (RRRRSA) formed an SDS- and heat-stable serpin/proteinase complex with PACE4 or PC6 and inhibited both enzyme activities. The RRRRSA variant was efficiently cleaved by furin without formation of the stable complex. This is the first report of a highly selective protein-based inhibitor of PACE4 and PC6. This inhibitor will be useful in delineating the roles of PACE4 and PC6 localized in the extracellular matrix.


A proteomic approach reveals transient association of reticulocalbin-3, a novel member of the CREC family, with the precursor of subtilisin-like proprotein convertase, PACE4

SPCs (subtilisin-like proprotein convertases) are a family of seven structurally related serine endoproteases that are involved in the proteolytic activation of proproteins. In an effort to examine the substrate protein for PACE4 (paired basic amino-acid-cleaving enzyme-4), an SPC, a potent protein inhibitor of PACE4, an alpha1-antitrypsin RVRR (Arg-Val-Arg-Arg) variant, was expressed in GH4C1 cells. Ectopic expression of the RVRR variant caused accumulation of the 48 kDa protein in cells. Sequence analysis indicates that the 48 kDa protein is a putative Ca2+-binding protein, RCN-3 (reticulocalbin-3), which had previously been predicted by bioinformatic analysis of cDNA from the human hypothalamus. RCN-3 is a member of the CREC (Cab45/reticulocalbin/ERC45/calumenin) family of multiple EF-hand Ca2+-binding proteins localized to the secretory pathway. The most interesting feature of the RCN-3 sequence is the presence of five Arg-Xaa-Xaa-Arg motifs, which represents the target sequence of SPCs. Biosynthetic studies showed that RCN-3 is transiently associated with proPACE4, but not with mature PACE4. Inhibition of PACE4 maturation by a Ca2+ ionophore resulted in accumulation of the proPACE4-RCN-3 complex in cells. Furthermore, autoactivation and secretion of PACE4 was increased upon co-expression with RCN-3. Our findings suggest that selective and transient association of RCN-3 with the precursor of PACE4 plays an important role in the biosynthesis of PACE4.


Pratamine: a unique and patent inhibitor of oligopeptidase B

Oligopeptidase B is a serine endopeptidase found in prokaryotes, unicellular eukaryotes and higher plants. The enzyme has been shown recently to play a central role in the pathogenesis of several parasitic diseases such as African trypanosomiasis, and to be a potential therapeutic target. This study reports that protamine, a basic peptide rich in arginine, is a potent inhibitor at the nanomolar level of oligopeptidase B from E. coli and wheat. Protamines 1B, 2C, 3A and TP17 displayed similar inhibitory activities and were capable of binding strongly to oligopeptidase B without proteolytic cleavage. The concentration of protamine needed for 50% inhibition (IC50) of oligopeptidase B was 10(4)-fold lower than the IC50 of trypsin. Oligopeptidase B was highly sensitive to inhibition by protamines even in the presence of serum (IC50, 1 microM). These data indicate that protamines might provide information useful for the design of more specific synthetic oligopeptidase B inhibitors.


Identification of Oligopeptidase B in Higher Plants. Purification and Characterization of Oligopeptidase B from Quiescent Wheat Embryo, Triticum aestivum

小麦発芽過程において，著明に活性が上昇するセリンプロテアーゼを見出し，小麦胚芽より各種クロマトグラフィーによって単一に精製した．精製酵素はオリゴぺプチダーゼbに類似した酵素学的性質を有するとともに，その部分アミノ酸配列も大腸菌やトリパノゾーマオリゴぺプチダーゼbの配列と極めて相同性が高かった．以上の結果より，今までバクテリアやトリパノゾーマのみ存在すると考えられていたオリゴペプチダーゼbは高等植物にも存在することが蛋白レベルで証明された．


Molecular cloning and expression analysis of novel wheat cysteine protease

小麦発芽過程で著明に発現量が増加する新規のシステインプロテアーゼのクローニングを行った．得られたcDNAから推定されるアミノ酸配列はこのプロテアーゼがパパインファミリーに属する新規のシステインプロテアーゼであることを示した．このプロテアーゼは小麦，大麦に存在し，米，シロイヌナズナには存在しなかった．抗体を作成し，その蛋白レベルにおける発現を調べると，発芽2日目以降に著明に増加することが判明し，小麦の発芽過程における細胞の増殖，分化に寄与している可能性が高い．

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects


The expression of proprotein convertase PACE4 is highly regulated by Hash-2 in placenta: Possible role of placenta-specific basic helix-loop-helix transcription factor, human Achaete-Scute homologue-2

培養細胞Bewoは絨毛癌に由来する培養細胞で，トロホブラスト細胞のモデル細胞として使われている．Bewo細胞にはPACE4が発現し，その発現はE-boxに結合するbHLH転写因子で制御されることを明らかにした．また，ヒト胎盤の免疫染色によってPACE4は胎盤トロホブラストの分化過程で発現量が変動することを見出した．


Secretory proprotein convertases PACE4 and PC6A are heparin-binding proteins which are localized in the extracellular matrix. Potential role of PACE4 in the activation of proproteins in the extracellular matrix

PACE4のヘパリンセファロースゲルに対する結合能を調べた．PACE4はヘパリンカラムに強く結合し，塩化ナトリウム1モル以上の濃度で溶出された．また，結合したPACE4はヘパリンで溶出されたが，コンドロイチン硫酸では全く溶出されなかった．PACE4のC末に塩基性アミノ酸に富んだヘパリン結合部位を同定した．さらに，培養細胞を用いてPACE4は細胞外マトリックスに存在するプロテオグリカン分子のヘパラン硫酸糖鎖に結合していることを証明した．

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics


The proprotein convertase PACE4 is upregulated by PDGF-BB in megakaryocytes: gene expression of PACE4 and furin is regulated differently in Dami cells

The differentiation of megakaryocytes into platelets is highly regulated by many cytokines and growth factors. PACE4 and furin are Ca(2+)-dependent serine endoproteases belonging to the subtilisin-like proprotein convertase (SPC) family. These enzymes are involved in the proteolytic activation of proteins that play essential roles in cell growth and differentiation. In this study, we examined the expression of PACE4 and furin during the differentiation of megakaryoblastic cell lines, Dami and HEL cells, induced by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). PMA stimulates not only the expression of platelet-derived growth factor-B (PDGF-B) mRNA, but also PACE4 mRNA in these cell lines. The expression of PACE4 transcripts (both the PACE4A and PACE4C/CS isoforms) was upregulated more than 4-fold by PMA. Moreover, direct treatment with PDGF-BB also resulted in an increase in the level of PACE4 mRNA. Further, the effect of PDGF-BB on PACE4 expression was confirmed by promoter assay of the PACE4 gene. Although the furin mRNA level was increased by TGF-beta1 in Dami cells, it was not affected by PDGF-BB. These results indicate for the first time that PACE4 expression is specifically upregulated by PDGF-BB in differentiated megakaryoblasts, suggesting a unique role for PACE4 in platelet production.

血小板の分化過程において，巨核芽球から血小板への分化は多くのサイトカインや分化因子によって高度に制御されている．本研究では，巨核芽球のモデル細胞であるDami, HEL細胞を用いて，分化因子前駆体を活性化するプロプロテインコンベルターゼ(SPC)の発現制御について解析した．SPCの中で，特にPACE4は細胞自身から分泌されるPDGFによって著明に発現量が増加することが判明し，PACE4は血小板の分化において重要な役割を持つことが示された


Development of selectivity of α1-antitrypsin variant by mutagenesis in its reactive site loop against proprotein convertase. A crutial role of the P4 arginine in PACE4 inhibition

ズブチリシンプロプロテインコンベルターゼ(SPC)は，哺乳類では7種類が同定されているが，これらの酵素は類似した基質特異性を持ち，さらに複数の酵素がひとつの細胞で発現しているため，その生理機能解析は困難である．本研究では，これらSPCの機能解析のツールとして使用できる選択的阻害特性を有する阻害タンパクを作成することを目的として，アンチトリプシンのタンパク工学的改変を行い，その阻害特異性について検討した．SPCの中でPACE4とFurinを識別可能な改変体を作成することができた．


A Critical Role for the Carboxy Terminal Region of the Proprotein Convertase, PACE4A, in the Regulation of Its Autocatalytic Activation Coupled with Secretion

ズブチリン様プロプロテインコンベルターゼファミリーであるPACE4は，自己活性化されたのち分泌されるが，培養細胞で過剰発現しても，その自己活性化速度が非常に遅いため，分泌される活性型酵素の量が少ない．本研究では，PACE4のC末端側に自己活性化を制御する領域があることを証明した．

Biochemical and Biophysical Research Communications


Proprotein convertase PACE4 is down-regulated by the basic helix-loop-helix transcription factor hASH-1 and MASH-1

Mash-1は，神経分化に必須のbHLH型転写因子であるが，その標的遺伝子は不明である．本研究では，種々のMash-1発現量の異なるヒト神経芽細胞腫を用いて，Mash-1のズブチリシン様プロプロテインコンベルターゼであるPACE4発現に及ぼす影響について検討し，Mash-1はPACE4遺伝子上流のE-boxクラスタに結合し，そのプロモーター活性をネガティブに制御する転写因子であることを証明した．


Highly regulated expression of subtilisin-like proprotein convertase PACE4 (SPC4) during dentinogenesis.

Expressions of mRNAs for four subtilisin-like proprotein convertases (SPCs: furin, PACE4, PC6, and PC8) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4) in the rat molar tooth during development were analyzed by Northern blotting, reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), and in situ hybridization to explore the possible involvement of SPCs in the processing of proBMPs. We found a temporospacial expression of PACE4, but not one of the other SPCs, in this tissue; i.e., RT-PCR analysis revealed that the level of PACE4 mRNA, but not that of the other SPC mRNAs became high around the second postnatal day. This increase was in good accordance with the increase in BMP4 mRNA, indicating an apparent association of these molecules with the differentiation and establishment of functional ameloblasts and odontoblasts. During dentinogenesis, PACE4 mRNA was localized in the ameloblasts and odontoblasts. These observations suggest that PACE4 plays a crucial role in dentinogenesis, especially via the activation of BMPs.

サチライシン様プロセシング酵素PACE4は遺伝子プロモーター領域の構造から，その発現は極めて複雑に制御されると考えられたが，生体内での発現制御については不明であった．本研究により，歯牙形成過程において実際に発現が複雑に制御されていること，また， この様な発現制御がファミリーの中でもPACE4に特有であることが初めて明らかになった．


Subtilisin-like proprotein convertase PACE4 (SPC4) is a candidate processing enzyme of bone morphogenetic proteins during tooth formation

サチライシン様プロセシング酵素PACE4が歯牙形成過程において時期·空間特異的に発現し，歯牙形成に必須の骨形成蛋白質群(BMPs)と一致して局在することから， PACE4が歯牙形成時の最も有力なBMPsプロセシング酵素で， BMPsの活性化によりエナメル芽細胞と象牙芽細胞の分化成熟と密接に関わることを見い出した．


Subtilisin-Like Proprotein Convertase, PACE4 and PC8, as Well as Furin, are Endogenous Proalbumin Convertases in HepG2 Cells

血清アルブミンはプロ体として肝臓で合成されたのち，細胞内でプロペプチドがプロセスされ血液中に分泌される．しかし このプロセシング機構についてはまだ不明な点が多い．本研究では，アンチセンスRNA法を用いて，ズブチリシン様プロプロテインコンベルターゼであるFurin, PACE4, PC8のアルブミンプロセシングにおける役割を解析し，Furinのみならず，PACE4, PC8もアルブミンプロセシングに関わっていることを証明した．


Inactivation of Proprotein Convertase, PACE4 by α1-Antitrypsin Portland (α1-PDX) which is a Blocker of Proteolytic Activation of Bone Morphogenetic Protein during Embryogenesis.

PACE4はSPCファミリーに属するプロテアーゼで，特に細胞分化過程でその発現量が高度に制御されているが，その機能に関しては不明な点が多い．本研究では，BMPの活性化を阻害し，細胞分化を抑制するアンチトリプシン改変体が，PACE4に対して強い阻害作用を持つことを証明し，PACE4がBMPプロセシングプロテアーゼとして機能していることを示唆した．またPACE4の酵素学的性質についても検討した．


Human Subtilisin-Like Proprotein Convertase, PACE4 (SPC4) Gene Expression Is Highly Regulated through E-Box Elements in HepG2 and GH4C1 Cells

ヒトPACE4の発現制御機構を明らかにするため，その遺伝子5'上流域の構造，機能解析を行った．ヒトPACE4遺伝子上流域には多くの転写因子結合サイトが認められたが，特に上流1kbにE-box配列が12個存在した．リポータージーンアッセイにより，E4-E9のE-boxクラスタが強力な負のエンハンサーとして機能していることを明らかにした．E-boxに結合するbHLH型転写因子は細胞分化を制御するものが多く，PACE4と細胞分化の関わりを示唆した．


Biosynthetic processing and quoternary interactions of proprotein convertase SPC4 (PACE4).

ズブチリン様プロプロテインコンベルターゼファミリーに属するPACE4の活性化機構について解析した．プロPACE4のプロペプチドの切断はPACE4の活性基を変異した不活性体では起こらず，また不活性体と活性体を共発現しても不活性体のプロセシングがなかったことから，このプロセシングは分子内自己活性化であることを証明した．また自己活性化はPACE4の分泌に必須であり，PACE4の活性化と細胞内移行は共役していることを明らかにした．


Biosynthetic processing and quaternary interactions of proprotein convertase SPC4 (PACE4).


Intermedilysin A cytolytic toxin specific for human cells of a Streptococcus intermedius isolated from human liver abscess in "Streptococci and The Host"

S. intermedius肝膿瘍分離株から単離されたヒト細胞特異的な細胞溶解毒素インターメディリシン(ILY)の性質を検討した．これまで知られていたチオール基修飾試薬への非感受性やコレステロールへの低感受性に加え，電子顕微鏡観察からILYは直径30-50nmの膜孔を形成し細胞を破壊することが示された．またILYの部分遺伝子構造解析の結果からILYはチオール活性化毒素群と同じ分子祖先から進化したものであることが示唆された．

Advances in Experimental Medicine and Biology


Genomic organization and alternative splicing of human PACE4 (SPC4), Kexin-like processing endoprotease.

本研究ではプロセシング酵素Kexin familyの1つPACE4のヒトゲノムを単離し, その構造を解析し, ファミリーの中でも最も大きく複雑な構造であること, 多種類存在するアイソフォームが全て同一遺伝子から選択的スプライシングにより生じること, およびプロモーター領域がユニークな構造であること等を初めて明らかにした.


Developmental expression of a novel Kexin family protease, PACE4E, in the rat olfactory system.

本研究では新規Kexin family proteaseであるPACE4Eがラット脳発生過程において時期·空間特異的に発現することを明らかにし, 特に嗅球においては僧帽細胞に極めて特異的に発現し, 僧帽細胞の分化成熟と密接に関わることを見い出した.


A Novel Human PACE4 Isoform, PACE4E Is an Active Processing Protease Containing a Hydrophobic Cluster at the Carboxy Terminus

ズブチリシン様プロプロテインコンベルターゼファミリーに属するPACE4の新規アイソフォームPACE4E-I, PACE4E-IIをヒト脳cDNAライブラリーよりクローニングした．PACE4Eは，PACE4Aと比べ，C末に75残基からなる，疎水性アミノ酸のクラスタを含むユニークな配列を持っていた．この部分を欠失したPACE4Eは分泌速度が上昇した．共発現実験によって，PACE4E-1, E-IIは，PACE4Aと同様にプロセシング活性を持っていることが証明された．


Intestinal anaerobic bacteria hydrolyse sorivudine, producing the high blood concentration of 5-(E)-(2-bromovinyl)uracil that increases the level and toxicity of 5-fluorouracil.

Sorivudine, 1-beta-D-arabinofuranosyl-5-(E)-(2-bromovinyl)uracil, is a potent antiviral agent against varicella-zoster virus and herpes simplex virus type 1. However, sorivudine should not be used in combination with anticancer drugs such as 5-fluorouracil (5-FU) because (E)-5-(2-bromovinyl)uracil (BVU), a metabolite of sorivudine, inhibits the degradation of 5-FU, resulting in its accumulation in the blood and marked enhancement of the toxicity of 5-FU. Since phosphorolytic enzymes generate BVU from sorivudine, we investigated the distribution of the enzyme activity in rats. High activity was found in the cecal and large intestinal contents, while very low or no detectable activity in the liver, kidney, stomach, cecum, large intestine, and the stomach and small intestinal contents. These results suggest that intestinal microflora play an important role in BVU production. Therefore, we measured the phosphorylase activity in cell-free extracts from 23 aerobes, 16 anaerobes and a fungus. Bacteroides species B. vulgatus, B. thetaiotaomicron, B. fragilis, B. uniformis and B. eggerthii, dominant members of intestinal microflora, had high activity to convert sorivudine to BVU. To elucidate the contribution of intestinal microflora to BVU production in vivo, we administered sorivudine to rats treated with several antibiotics and measured the BVU concentration in the serum of rats. When sorivudine was given to rats treated with ampicillin or a mixture of bacitracin, neomycin and streptomycin, which decreased the numbers of viable aerobes and anaerobes, only a small amount of BVU was found in the serum. BVU concentration in the serum of rats treated with metronidazole to decrease the number of intestinal anaerobes was also very low. In contrast, BVU concentration in the serum of rats treated with kanamycin, which was used to decrease the number of aerobes selectively, was higher than that of non-treated rats. These results also suggest that BVU is produced by intestinal anaerobic bacteria especially Bacteroides species in vivo.


Cyclic AMP-inducible procalcitonin processing in thyroidal parafollicular cells is regulated by the kexin family protease, PC1

甲状腺におけるカルシトニンのプロセシングに関与するズブチリシン様プロプロテインコンベルターゼを同定するため，特異抗体による免疫染色とモデル細胞TT細胞におけるcAMPの影響について調べた．カルシトニン産生細胞で発現していたのは，主にPC1とPC2であったが，カルシトニンの産生を刺激するcAMPによって発現が増加したのは，PC1であった．これらの結果は，PC1がプロカルシトニンの活性化酵素であることを示している．


Intermedilysin, a novel cytotoxin specific for human cells, secreted by Streptococcus intermedius UNS46 isolated from a human liver abscess

S. intermediusのヒト肝膿瘍分離株がヒト細胞特異的な細胞溶解毒素インターメディリシン(ILY)を分泌することを発見した． ILYは約54KDaの蛋白で，その部分一次構造はニューモリシンと高い相同性を示した． しかしSH修飾試薬により失活せず，コレステロール対しても感受性が低かった． またトリプシン処理したヒト赤血球はILYに対して抵抗性を示すようになることから，ILY作用には宿主細胞膜の蛋白質が関与している事が示された．


Purification and characterization of a novel serine proteinase from the microsomal fraction of bovine pancreas.

牛膵臓膜画分より，CHAPSによる可溶化，ゲルろ過，トリプシンインヒビターセファロース，アルギニンーセファロースによって，新規のトリプシン様セリンプロテアーゼを単一に精製した．この酵素は分子量29500で，グルカゴンを用いて切断特異性を調べると，塩基性アミノ酸とロイシンのC末側を切断した．N末のアミノ酸配列は，エラスターゼIV, II, IIIに類似していた．


Novel members of mammalian kexin family proteases, PACE4C, PACE4D, PC7A and PC7B.


Distribution of the kexin family proteases in pancreatic islets. --- PACE4C is specifically expressed in B cells of pancreatic islets

Kexin Family Proteasesはペプチドホルモン等のプロセシング酵素として同定され, 血糖調節ホルモンのインスリン等のプロセシングにも関与することが示唆されていたが, 本研究では我々が新規にクローニングしたPACE4CをはじめとするKexin Family Proteasesとインスリン等との膵島細胞での局在, 共存関係を初めて明らかにし, その成果は雑誌表紙にも掲載された.


A Novel Member, PC7, of The Mammalian Kexin-Like Protease Family --- Homology to PACE4A, Its Brainspecific Expression and Identification of Isoforms

哺乳類には7種類のKexin様プロプロテインコンベルターゼが存在する．哺乳類Kexin様プロテアーゼ間で保存された触媒領域のプライマーを用い，ラット脳下垂体からcDNA断片をPCR増幅し，これをプローブにしてラット脳下垂体cDNAライブラリーからPC7をクローニングした．PC7(PC7AとPC7B)はRXKRの活性化サイトを持ち，触媒，HomoB及びシステインリッチ領域を持っており，PACE4Aと非常に高いホモロジーを示した．PC7は脳で強く発現し，肝，腎，心，脾では検出されなかった．

Biochemical and Biophysical Research Communications


The tissue distribution of mRNAs for the PACE4 isoforms, kexin-like processing protease: PACE4C and PACE4D mRNAs are major transcripts among PACE4 isoforms

新たに見いだされたPACE4アイソフォーム(PACE4CとPACE4D)の組織分布をRT-PCR法を用いて解析した． 両アイソフォームのmRNAともに，PACE4Aと同様に多くの組織で見いだされたが，それぞれの発現パターンは異なっていた．また，PACE4C及びPACE4DのmRNAはPACE4Aのそれより遙かに多く，PACE4 mRNAの主要な部分はPACE4CとPACE4DのmRNAである事が示唆された．


Lysosomal enzyme replacement using α2-macroglobulin as a transport vehicle

α2-マクログロブリン(α2M)を運搬担体に用いたリソソーム酵素欠損性遺伝病の酵素補充療法システムを開発した． α2Mはレセプターを介してリソソームに取り込まれることから，豚肝臓から精製した α-グルコシダーゼ或いはα-ガラクトシダーゼにα2Mを運搬担体として二価架橋試薬で連結し，リソソーム指向性の酵素補充療法剤を構築した． これを用いてin vitro実験を行い，ポンペ病及びファブリー病細胞の細胞病態が改善されることを証明した．


Identification of Novel cDNAs Encording Human Kexin-like Protease, PACE4 Isoforms

ヒト胎盤cDNAライブラリーより，新規のPACE4アイソフォーム，PACE4CとPACE4Dをクローニングし，塩基配列を決定した．PACE4Cは，PACE4AのC末に存在するシステインリッチ領域を持たず，ホモBドメインのC末にC-特異的配列を持っていた．PACE4Dはシグナルペプチド，プロペプチドおよびシステインリッチ領域を欠失していた．


Identification of targeting proteinase for rat α1-macroglobulin in vivo. --- Mast-cell tryptase is a major component of the α1-macroglobulin-proteinase complex endocytosed into rat liver lysosomes.

血清蛋白質であるα-マクログロブリン(αM)は種々の酵素に対するインヒビターとして機能すると考えられていたが, 生体内で標的となる酵素は不明であった. 本研究ではαMが酵素と複合体形成後, リソゾームに運ばれ分解されることに着目し, リソゾーム内の分解を抑制したラット肝臓リソゾームよりαM-酵素複合体を単離し, 肥満細胞トリプターゼが生体内でαMの標的酵素の1つであることを初めて明らかにした.


Differences in the sugar chains of two subunits and isozymic forms of rat kidney γ-glutamyltranspeptidase

本研究は，ラット腎γ-グルタミルトランスぺプチダーゼを構成する2種のサブユニットの糖鎖構造を各々明らかにしたものである．


Structural studies of the carbohydrate moieties of rat kidney γ-glutamyltranspeptidase

本研究は，ラット腎γ-グルタミルトランスペプチダーゼの糖鎖構造を調べたもので，極めて多様性に富む糖鎖構造の概要が明らかにされた．


Studies on the structure of γ-glutamyltranspeptidase. III. Evidence that the amino terminus of the heavy subunit is membrane binding segment

γ-グルタミルトランスペプチダーゼの膜結合様式について詳細に検討し，ヘビーサブユニットのアミノ末端付近の疎水性アミノ酸に富む部分が膜との結合に関与していることを明らかにした．


Immunological cross reactivity of γ-glutamyltranspeptidase from human and rat kidney, liver and bile

本研究は，ヒト腎及びラット腎よりγ-グルタミルトランスペプチダーゼを精製し，各々特異抗体を調製したのち，ラット腎，肝及びヒト腎，胆汁中のγ-グルタミルトランスペプチダーゼの免疫学的性質を比較検討した．


Studies on the structure of γ-glutamyltranspeptidase. I. Correlation between sialylation and isozymic

本研究は，γ-グルタミルトランスペプチダーゼの等電点多様性とシアル酸含量の関係を調べたもので，等電点の多様性は，タンパク部分ではなく糖鎖中のシアル酸含量の違いによることを明らかにした．


Studies on the structure of g-glutamyltranspeptidase. II. Location of the segment anchoring γ-glutamyltranspeptidase to the membrane

本研究は，γ-グルタミルトランスペプチダーゼの膜結合様式について調べたもので，ヘビーサブユニットのアミノ末端付近に膜結合部位があることを明らかにした．


Characterization of human serum γ-glutamyltranspeptidase

本研究は，ヒト血清，胆汁中のγ-グルタミルトランスペプチダーゼの構造比較を行い，本酵素の血液·胆汁中への遊出機序について検討した．


Purification and characterization of γ-glutamyltranspeptidase from human bile

本研究は，ヒト胆汁よりγ-グルタミルトランスペプチダーゼを単一に精製し，その性質を調べた．


Studies on liver argininosuccinate synthetase in a patient with citrullinemia and in normal subjects

本研究は，肝生検試料を用いてシトルリン血症患者のアルギノコハク酸合成酵素の性質を正常者酵素と比較したもので，患者酵素の動力学的性質に異常を認め，臨床症状と酵素異常の関係を論じた．


本研究は，実験的肝炎，脂肪肝のウサギ血清オルニチントランスカルバミルトランスフェラーゼ活性を調べ，血清オルニチントランスカルバミルトランスフェラーゼ活性値は，脂肪肝の指標になることを示した．


新医薬品の開発をめざした脳神経特異的発現遺伝子産物のプロテオミクス解析

新医薬品の開発をめざした脳神経特異的発現遺伝子産物のプロテオミクス解析

本論文では，新薬開発における新規標的分子の同定のための脳神経特異的遺伝子産物のプロテオミクス解析に関する成果を報告した．

Bulletin of Faculty of Engineering, The University of Tokushima


Proteolytic Cleavage of the Neural Cell Adhesion Molecule L1 by Subtilisin-Like Proprotein Convertases

L1蛋白質は神経の分化，機能と関係していると考えられている接着蛋白である．L1蛋白質はプロセス部位にSubtilisin-like proprotein convertaseの切断配列である塩基性アミノ酸対を持っているが，そのプロセシング機構は不明である．本研究では，L1蛋白質のプロセシングに関与するプロテアーゼについて，特にSPCについて検討した．培養細胞でL1蛋白質前駆体とSPC (furin, PACE4, PC6, PC1, PC4, PC8)を共発現すると，furin, PACE4, PC6によってプロセシングされることが判明した．

Keio University Symposia for Life Science and Medicine