Effect of different concentrations of eugenol in maturation medium on the maturation, oxidative status, and developmental competence of porcine oocytes.

The 51th Conference of the International Embryo Technology Society,


Trial to generate chimeric pigs with high-frequency renal tumors via aggregation of gene-edited blastomeres.


Genome editing of porcine zygotes through the lipofection of a CRISPR/Cas9 system with two guide RNAs.

The 50th Conference of the International Embryo Technology Society


Quality and fertilization of frozenthawed porcine spermatozoa separated using migration sedimentation.


Development of porcine embryos cultured in media irradiated with ultraviolet at 228 and 260 nm wavelength.


Comparison of chemically mediated CRISPR/Cas9 gene-editing systems using different transfection mechanisms on the mutation of porcine embryos.

The 17th Transgenic Technology Meeting (TT2022)


Effects of CRISPR/Cas9-mediated gene targeting of porcine endogenous retrovirus on the developmental competence of porcine embryos

The 15th Transgenic Technology Meeting (TT2019)


Efficiency of gene editing by electroporation of Cas9 protein (GEEP) to generate GGTA1-modified pigs


Effect of Cas9 protein levels on genomic mutations using the gene editing by electroporation of Cas9 protein (GEEP) system in putative zygotes


Assessment of PDX-1-deficient pigs generated using the CRISPR/Cas9 system introduced into porcine zygotes via electroporation


Effects of voltage strength on development and quality of electroporated porcine embryos.


Generation of TP53-modified pigs by GEEP method: CRISPR/Cas9-mediated gene modification introduced into porcine zygotes by electroporation.


A simple-step generation of genetically modified pigs by genome editing by electroporation of Cas9 protein (GEEP) method.

Forth World Congress of Reproductive Bioligy (WCRB2017)

Pigs are considered as one of the best animals for generating models of human diseases and for providing organs for xenotransplantation. Currently, genetically modified pigs for biomedical applications have been mainly generated using the somatic cell nuclear transfer (SCNT) technique after the generation of engineered donor somatic cells. However, this approach requires complex micromanipulation techniques and a long time for preparing enough number of reconstructed embryos to be transferred to the surrogate pig. Recently, we have established a simple method for CRISPR /Cas9 gene editing that involves the introduction of Cas9 protein and single-guide RNA into in vitro-fertilized zygotes by electroporation. The use of gene editing by electroporation of Cas9 protein (GEEP) resulted in highly efficient targeted gene disruption and was validated by the efficient production of Myostatin mutant pigs. While the genotype of genetically modified pig generated using the SCNT is homogeneous, the introduction of CRISPR/Cas9 system into embryos may induce mosaic genotype. However, GEEP method will be a powerful tool to achieve gene modification in the pig. We are now applying this method to generate various kinds of gene-modified pigs as an intractable disease model. We introduce recent studies and trials for generating genetically modified pigs by GEEP method.


Evaluation of the Leydig cell function on crossbreeding yak showing infertility.


細胞保存液を用いたブタ卵母細胞の常温保存後の発育能

細胞保存液を用いたブタ卵母細胞の常温保存後の発育能

第117回日本繁殖生物学会

第117回日本繁殖生物学会


エルゴチオネイン添加によるブタ卵母細胞の体外成熟能および発育に及ぼす影響

エルゴチオネイン添加によるブタ卵母細胞の体外成熟能および発育に及ぼす影響

第117回日本繁殖生物学会

第117回日本繁殖生物学会


Effect of porcine follicle fluid with the different oxidation stress indices on the meiotic competence and DNA integrity of porcine oocytes

第117回日本繁殖生物学会

第117回日本繁殖生物学会


Efficient gene editing of pig embryos by combining electroporation and lipofection methods depends on gRNA sequence.

第117回日本繁殖生物学会

第117回日本繁殖生物学会


ウェアラブル血流計を用いた外陰部血流量測定による牛の卵胞個数の予測

ウェアラブル血流計を用いた外陰部血流量測定による牛の卵胞個数の予測


ヤクー牛雑種の雄性不稔に関わる精巣上体細胞サイズの検討

ヤクー牛雑種の雄性不稔に関わる精巣上体細胞サイズの検討

第46回日本分子生物学会年会

第46回日本分子生物学会年会


手術トレーニング施設を目的別に有効活用してシュミレーションする，若手呼吸器外科医のための高難度手術教育

第85回日本臨床外科学会総会

第85回日本臨床外科学会総会


U-40呼吸器外科医が高難度手術手技を習得するための取り組み

U-40呼吸器外科医が高難度手術手技を習得するための取り組み

第40回日本呼吸器外科学会学術集会

第40回日本呼吸器外科学会学術集会


ゲノム編集による生物医学研究・外科トレーニング用ブタの作出

ゲノム編集による生物医学研究・外科トレーニング用ブタの作出

日本ゲノム編集学会 第8回大会

日本ゲノム編集学会 第8回大会


Culture method and transfection reagent combinations in genome editing by lipofection in pig zygotes.

ブタ胚における細胞質内脂肪滴の偏在化がゲノム編集効率に及ぼす影響


Culture method and transfection reagent combinations in genome editing by lipofection in pig zygotes.


ブタ胚における細胞質内脂肪滴の偏在化がゲノム編集効率に及ぼす影響

ブタ胚における細胞質内脂肪滴の偏在化がゲノム編集効率に及ぼす影響


細胞保存液セルストアSを用いたヒト脂肪由来間葉系幹細胞の常温保存における凝集と保存液中酸素分圧の関係

第22回日本再生医療学会

第22回日本再生医療学会


第22回日本再生医療学会

第22回日本再生医療学会


Triple gene editing in porcine embryos using a combination of microinjection, electroporation, and transfection methods.


Lipofection-mediated introduction of CRISPR/Cas9 system into porcine zygotes.

第114回日本繁殖生物学会

第114回日本繁殖生物学会


ノックアウトブタ由来精子を用いた体外受精胚におけるゲノム編集効率の検討

ノックアウトブタ由来精子を用いた体外受精胚におけるゲノム編集効率の検討

第114回日本繁殖生物学会

第114回日本繁殖生物学会


エレクトロポレーションを用いたCRISPR/Cas9システムのブタ体外受精卵への導入によるCD163遺伝子改変ブタの作製

第162回日本獣医学会学術集会

第162回日本獣医学会学術集会


ブタ体外受精卵におけるCrispr/Cas9システムを使用したゲノム編集の効率

ブタ体外受精卵におけるCrispr/Cas9システムを使用したゲノム編集の効率

日本ゲノム編集学会 第3回大会

日本ゲノム編集学会 第3回大会

ブタは生理学的および解剖学的にヒトに近い優れたモデル動物である．これまで遺伝子改変ブタの作製は，遺伝子改変を行った体細胞を用いた核移植によるクローンブタの作製によりなされてきた(体細胞クローン法)．さらに近年Crispr/Cas9システムをはじめとするゲノム編集技術が体細胞の遺伝子改変に活用されている．体細胞クローン法ではbiallelic変異個体を一代で得られるという利点があるが，遺伝子改変細胞株の樹立からクローン胚作製と高度な手技および時間が必要であり，さらに正常産仔の作製効率も未だ低く，実施できる研究者・研究機関は限られている．この問題を解決するため，発表者らはブタ体外受精卵に対しエレクトロポレーションにより CRISPR/Cas9 システムを導入し，簡便かつ高効率に遺伝子改変を行うGEEP法(Genome editing by electroporation of Cas9 protein)を確立した．この手法によりすでに複数のゲノム編集ブタ作製に成功しているが，得られたゲノム編集ブタの解析から，biallelic変異個体の作製に成功しているもののwt配列の残るモザイク個体も存在することがわかり，GEEP法においてモザイク個体率を下げることが課題となっている．今回，ブタ体外受精卵および産仔について，ゲノム編集ブタ作製に使用するガイドRNAとエレクトロポレーションによる導入条件，およびモザイク率の関連を複数の標的遺伝子で解析した．その結果，適切なガイドRNAおよびエレクトロポレーション条件の選択により，biallelic変異個体を一代で得られる可能性が示唆された．


ブタ内在性レトロウイルス遺伝子を標的としたゲノム編集が胚発育能に及ぼす影響

ブタ内在性レトロウイルス遺伝子を標的としたゲノム編集が胚発育能に及ぼす影響

日本ゲノム編集学会第3回大会

日本ゲノム編集学会第3回大会

近年，再生医療技術およびゲノム編集技術の進展に伴い，ブタの組織・臓器を用いた異種移植が現実味を帯びてきた．一方，ブタゲノム中にはブタ内在性レトロウイルス(PERV)が多数内在されており，移植後におけるヒトへの感染が懸念されている．ゲノム編集技術により，ブタゲノム中に存在するPERV遺伝子をノックアウトすることにより，PERV感染の制御が可能と考えられるが，内在性レトロウイルスの初期発生との関連性，特に，初期胚発育能に及ぼす影響は未知数である．我々は，これまでにエレクトロポレーションによりCRISPR/Cas9システムをブタの1細胞期体外受精卵に導入することで，ゲノム編集を高効率に行い，かつ胚の生存性を維持できるGEEP法(genome editing by electroporation of Cas9 protein)を確立した．本研究ではブタの体外受精卵において，細胞内でPERV 自身を複製する際に重要なpol 遺伝子を標的にGEEP法によりノックアウトし，ゲノム編集効率と胚発育の関連性を調査した．pol遺伝子を標的とするguideRNA(gRNA)を5種類作製し，それぞれのgRNAをCas9タンパク質とともにブタの体外受精卵に導入した．その結果，一部のgRNA導入群において胚盤胞形成率が非常に低い値を示した．これらの群において4-8細胞期のゲノム編集効率を検討したところ，編集効率は他の群よりも高い値を示し，ゲノム編集効率と胚盤胞形成率に負の関連性が認められた．このことから，PERV遺伝子は胚発生と関連していることが示唆された．


GEEP法によるGGTA1遺伝子およびCMAH遺伝子の同時改変ブタの作出

GEEP法によるGGTA1遺伝子およびCMAH遺伝子の同時改変ブタの作出

第24回日本異種移植研究会

第24回日本異種移植研究会


CRISPR/Cas9システムによるブタ体外受精卵のINS遺伝子への点変異導入

CRISPR/Cas9システムによるブタ体外受精卵のINS遺伝子への点変異導入

第7回日本先進医工学ブタ研究会

第7回日本先進医工学ブタ研究会


GEEP法を用いた遺伝子改変ブタの作製と遺伝子改変効率

GEEP法を用いた遺伝子改変ブタの作製と遺伝子改変効率

第7回日本先進医工学ブタ研究会

第7回日本先進医工学ブタ研究会


ブタ体外受精卵におけるCRISPR/Cas9システムを用いた複数遺伝子の同時改変

第7回日本先進医工学ブタ研究会

第7回日本先進医工学ブタ研究会


Concentration of CRISPR/Cas9 components effects on genetic mosaicism of cytoplasmic microinjected porcine embryos

第6回日本先進医工学ブタ研究会

第6回日本先進医工学ブタ研究会

Cytoplasmic microinjection (CI) of the CRISPR/Cas9 system enabled the induction of site-specific mutations in porcine zygotes and resulting pigs, but mosaicism is a serious problem for genetically modified pigs because of the complicated analysis of phenotypes. In the present study, we examined the suitable timing and concentration of CRISPR/Cas9 for introduction into oocytes/zygotes by CI to reduce mosaicism in the resulting blastocysts. In the first experiment, we introduced 20 ng/μl of Cas9 protein and gRNA, targeting the α-1,3-galactosyltransferase (GalT) gene in oocytes before in vitro fertilization (IVF), in zygotes after IVF, or in oocytes and zygotes before and after IVF twice. CI treatment had no detrimental effects on the blastocyst formation rates, but the number of mutant blastocysts from zygotes injected after IVF tended to increase compared to that from oocytes injected before IVF (p < 0.1). In the second experiment, we injected 20 ng/μl or 100 ng/μl of Cas9 protein and gRNA into zygotes after IVF. Although no blastocysts that were injected with 20 ng/μl of Cas9 protein and gRNA carried a biallelic mutation, 50% of blastocysts that were injected with 100 ng/μl of Cas9 protein and gRNA carried a biallelic mutation. In conclusion, to achieve efficient gene editing in porcine zygotes by CI of Cas9 protein with gRNA, performing CI after IVF is better than performing CI before IVF. Furthermore, increasing the concentration of Cas9 protein and gRNA is effective in generating biallelic mutant blastocysts. To reduce mosaicism, however, further optimization of the timing of CI and the concentration of CRISPR/Cas9 components is needed.


Hypothermic storage of porcine zygotes in serum supplemented with chlorogenic acid

第6回日本先進医工学ブタ研究会

第6回日本先進医工学ブタ研究会

The current study was conducted to investigate the effects of 100% fetal bovine serum (FBS) and 100% porcine follicular fluid (pFF) as a storage medium on the developmental competence of porcine zygotes stored at 25°C for 24 h. Moreover, we evaluated the additive effects of chlorogenic acid (CGA) in the storage medium. When in vitro-produced zygotes were stored at 25°C for 24 h in tubes containing either tissue culture medium (TCM) 199 supplemented with 1 mg/mL bovine serum albumin (BSA), 100% of FBS or 100% of pFF, the rate of blastocyst formation was significantly higher in 100% of FBS than in BSA-containing TCM 199. When the effects of CGA supplementation in 100% of FBS on the development of zygotes stored at 25°C for 24 h was evaluated, more zygotes stored with 50 µM CGA developed to blastocysts compared with the other concentrations of CGA. When the formation date and quality of blastocysts derived from zygotes stored in 100% of FBS supplemented with 50 µM CGA were investigated, the highest ratio of blastocysts formation in the storage group appeared 1 day later than in the non-stored control group. However, a higher proportion of blastocysts with apoptotic nuclei was observed in the stored group as compared to the non-stored group. In conclusion, 100% of FBS is available for a short storage medium of porcine zygotes. The supplementation of 50 µM CGA into the storage medium improves the rates of blastocyst formation of zygotes after storage, but the quality of embryos from the stored zygotes remains to be improved.


ブタにおける受精前後でのゲノム編集が胚盤胞の変異導入効率に及ぼす影響

ブタにおける受精前後でのゲノム編集が胚盤胞の変異導入効率に及ぼす影響

第6回日本先進医工学ブタ研究会

第6回日本先進医工学ブタ研究会

CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術の登場により，ブタを含む様々な動物種において迅速な遺伝子改変が可能となったが，ゲノム編集による遺伝子改変動物の作製の際にはモザイク個体の発生が問題となっている．我々は，これまでに1細胞期のブタ体外受精卵へCRISPR/Cas9システムを電気穿孔により導入し，ゲノム編集を行うGEEP法を確立した．本研究では，GEEP法により体外受精前のブタ成熟卵および体外受精後の1細胞期胚にMSTN遺伝子およびFGF10遺伝子を標的とする2種のsingle-guideRNA(sgRNA)をCas9タンパク質とともにそれぞれ導入し，ゲノム編集を行うタイミングが胚盤胞でのゲノム編集効率に及ぼす影響を調べた． 電気穿孔を行う際の電圧パルス数は3パルスあるいは5パルスとした．GEEP法によるCRISPR/Cas9システムの導入後，得られたそれぞれの胚盤胞における変異の導入を解析した．今回解析したすべての胚盤胞において，Bi-allelic変異は確認できなかった．変異導入率(標的配列付近に変異が導入された胚盤胞数 / 解析した全胚盤胞数)を比較したところ，成熟卵でゲノム編集を行った胚盤胞の変異導入率(55–57%)と1細胞期胚でゲノム編集を行った胚盤胞の変異導入率(58–60%)に差はみられなかった． 次に変異が導入された胚盤胞について，各変異導入胚盤胞における変異導入効率を比較した．FGF10遺伝子を標的とし，3パルスの電圧でCRISPR/Cas9システムを導入した際，成熟卵由来の胚盤胞では1細胞期胚由来の胚盤胞と比較して，変異導入効率が有意に高かった．MSTN遺伝子を標的とした際には各群間で差は認められなかった． これらの結果より，ブタの成熟卵および1細胞期胚において高効率にゲノム編集を行うためには，sgRNAを設計後，それぞれのsgRNAについてゲノム編集を行うタイミングや導入条件を含めて事前に十分に検討する必要性が示唆された．


ゲノム編集によるTP53遺伝子改変ブタの作製と表現型の解析

ゲノム編集によるTP53遺伝子改変ブタの作製と表現型の解析

第6回日本先進医工学ブタ研究会

第6回日本先進医工学ブタ研究会


Modification of SALL1 gene via CRISPR/Cas9-mediated gene editing introduced into porcine zygotes by electroporation

KEY Forum: The 3rd International symposium on Stem Cell Traits and Developmental Systems


ゲノム編集技術を用いたブタでの応用例

ゲノム編集技術を用いたブタでの応用例

第3回日本生物工学会西日本支部講演会「ゲノム編集—多様な生物種への応用研究」

第3回日本生物工学会西日本支部講演会「ゲノム編集—多様な生物種への応用研究」


新規ゲノム編集技術を用いたPDX-1遺伝子改変ブタの作製

新規ゲノム編集技術を用いたPDX-1遺伝子改変ブタの作製

第4回 日本先進医工学ブタ研究会 要旨集

第4回 日本先進医工学ブタ研究会 要旨集